​近日，上海复旦大学的周翔、吴晓华教授在Molecular Cancer（IF:41.44, Q1）杂志上发表了题为“FBW7 suppresses ovarian cancer development by targeting the N6-methyladenosine binding protein YTHDF2”的研究。该研究揭示了FBW7通过拮抗YTHDF2介导的BMF mRNA在卵巢癌中的衰变来抑制肿瘤生长和进展。

一、背景

上皮性卵巢癌 (EOC) 是与全世界女性死亡相关的最常见的癌症类型。尽管手术和靶向化疗治疗取得了进展，但由于复发和化疗耐药性，其预后仅略有改善。因此，深入了解EOC的致病机制对于制定新的治疗策略和改善EOC患者的整体预后具有重要意义。总的来说，作者如下详述的研究证明了FBW7-YTHDF2-BMF级联在抑制卵巢癌中的作用。

二、结果1. FBW7与不良预后和m6A修饰有关

● 由于缺乏关于FBW7在卵巢癌中作用的证据，作者首先通过比较FBW7在癌变和非癌变卵巢组织中的表达来确定其临床意义。FBW7在卵巢癌组织中显著下调（图1A、B和补充图1A）。同样，还发现FBW7在586个卵巢癌样本的TCGA RNA-Seq数据集中显著减少（补充图1B）。接下来，通过免疫组织化学(IHC)染色分析包含120个肿瘤样本的卵巢癌组织微阵列中的FBW7表达，因此，可以将卵巢癌样本分为FBW7低表达或高表达水平的两组（图1C和D）。然后，作者探讨了FBW7表达与卵巢癌临床病理特征之间的关系。然而，在FBW7表达与年龄、肿瘤分期、腹水、淋巴结转移或绝经之间未观察到显著相关性（补充表S2；P0.05）。Kaplan-Meier生存分析表明，高水平的FBW7与卵巢癌的总体生存率显著相关（图1E），这与TCGA卵巢癌队列的结果一致（补充图1C）。此外，高水平的FBW7较好地与无进展生存期(PFS)适度但不显著相关（图1F），这可能是由于样本量有限。因此，这些观察结果表明FBW7是一种有利的预后标志物，可以抑制卵巢肿瘤的发生和发展。

【图1】【补充图1】2. FBW7作为卵巢癌肿瘤抑制剂

● 为了研究FBW7在卵巢癌中的生物学功能，作者生成了FBW7稳定过表达的SKOV3和OVCAR429细胞系，它们都维持内源性FBW7的低表达水平（图2A，补充图2）。FBW7的过表达显着抑制卵巢癌细胞增殖（图2B）、集落形成能力（图2C）和不依赖贴壁的细胞生长（图2D）。肿瘤抑制活性可归因于细胞凋亡的诱导，因为异位FBW7显着增加了膜联蛋白V阳性细胞群（图2E）。此外，作者建立了异种移植小鼠模型来测试FBW7是否在体内抑制卵巢肿瘤生长。根据基于细胞的结果，异位FBW7显着抑制了小鼠的肿瘤生长（图2F），这反映在与对照组相比时肿瘤体积和重量的显著抑制（图2G和H）。此外，作者还使用两个独立的shRNA生成了FBW7耗尽的HeyA8和OVCAR8卵巢癌细胞系（补充图3A）。同样，FBW7的消融显著促进卵巢癌细胞增殖（补充图3B）、集落形成能力（补充图3C）和贴壁非依赖性细胞生长（补充图3D）。总之，这些结果表明FBW7在卵巢癌中发挥肿瘤抑制作用。

【图2】【补充图2】【补充图3】3. FBW7诱导YTHDF2的泛素化降解

●为了破译FBW7介导的m6A修饰系统调节背后的分子机制，作者使用抗FBW7抗体结合质谱分析进行了CO-IP测定，以鉴定FBW7中的FBW7相互作用蛋白（补充图4A-C），该筛选将YTHDF2鉴定为FBW7结合蛋白之一。为了验证这种相互作用，作者进行了相互CO-IP测定，并确实验证了FBW7与SKOV3癌细胞中的YTHDF2结合（图3A）。免疫荧光(IF)染色表明相互作用可能发生在细胞质中（图3B）。由于FBW7是SCFE3-泛素连接酶的一个组成部分，作者试图确定FBW7是否通过它们的物理相互作用调节YTHDF2蛋白稳定性。通过将FBW7编码质粒引入SKOV3和OVCAR429细胞，作者发现YTHDF2的蛋白质水平在FBW7过表达后急剧下降，而这种减少通过用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞而完全恢复（图3C）。此外，如放线菌酮追踪实验所示，FBW7的过表达缩短了YTHDF2蛋白的半衰期（图3D）。与这些结果一致，作者还表明FBW7显着增强了YTHDF2泛素化（图3E），这已通过使用抗YTHDF2抗体的另一组泛素化测定法验证（图3F）。因此，这些发现表明，FBW7促使卵巢癌中YTHDF2泛素化介导的蛋白水解降解，从而调节m6A修饰系统。

【图3】【补充图4】4. YTHDF2与FBW7及预后呈负相关

● 由于YTHDF2是肿瘤抑制因子FBW7降解的底物，作者探究了这两种蛋白质之间的负相关是否也存在于原发性卵巢癌组织中。首先，作者分析了YTHDF2在癌变和非癌变卵巢组织中的表达，发现YTHDF2在卵巢癌中经常升高（图4A）。一致地，在TCGA数据库中，与正常卵巢组织相比，YTHDF2在卵巢癌样本中显著上调（补充图5A）。然后，作者如上所述使用卵巢癌组织微阵列检查了YTHDF2的表达（图1C），并且确实发现YTHDF2和FBW7的表达呈负相关（图4B和C），这与如图3C-F所示结果一致。根据YTHDF2的表达水平，将这些肿瘤标本分为两组（图4D），并分析每组的临床病理特征。然而，YTHDF2表达与年龄、肿瘤分期、腹水或淋巴结转移之间未观察到显着相关性（补充表4、补充表5）。Kaplan-Meier生存分析显示，YTHDF2表达增加与卵巢癌较差的总生存期(OS)显着相关（图4E），这与TCGA卵巢癌队列的结果一致（补充图5B）。然而，YTHDF2不是无进展生存期(PFS)的合适预后标志物（图4F）。并且FBW7高表达/YTHDF2低表达组的OS优于BW7低表达/YTHDF2高表达组（补充图13）。在多变量分析中，YTHDF2表达是OS的不良独立预后因素（补充表6）。因此，这些观察结果强烈表明YTHDF2可能促进卵巢癌的存活和生长。

【图4】【补充图5】【补充图13】5. YTHDF2促进卵巢癌的进展

●尽管发现YTHDF2与多种癌症的发展有关，但该蛋白是否是卵巢癌细胞存活和生长所必需的，这在很大程度上仍然难以捉摸。为了验证这一推测，使用两个独立的shRNA生成了YTHDF2耗尽的SKOV3和OVCAR420细胞系（图5A）。作者发现，YTHDF2的消融显著抑制了两种卵巢癌细胞系的增殖（图5b）、集落形成能力（图5C）和贴壁非依赖性生长（图5D）。此外，流式细胞术分析表明，YTHDF2的敲低会引发卵巢癌细胞凋亡（图5E）。此外，异种移植小鼠模型显示，YTHDF2耗竭显著阻碍了体内卵巢肿瘤的生长（图5F），导致肿瘤体积和重量显著减少（图5G和H）。YTHDF2的敲低显著恢复了FBW7耗竭诱导的细胞增殖和集落形成能力（图5I-K）。因此，这些发现表明YTHDF2对卵巢癌细胞增殖至关重要。为了证实这些结果，作者还评估了异位YTHDF2在卵巢癌细胞系中的生物学功能。通过检查YTHDF2在多个卵巢癌细胞系中的表达，作者使用维持内源性YTHDF2相对低表达的OVCAR433和OVCAR8细胞生成了YTHDF2稳定过表达谱系（补充图6和7A）。正如预期的那样，YTHDF2的过表达显著促进了细胞增殖（补充图7B）、集落形成能力（补充图7C）和不依赖锚定的生长（补充图7D）。总的来说，作者证明了YTHDF2可能促进卵巢癌的发展，并且FBW7通过诱导蛋白水解降解从而损害YTHDF2的致癌活性来抑制卵巢癌发生。

【图5】【补充图6】【补充图7】6. BMF是FBW7-YTHDF2级联效应器

●由于YTHDF2被证明会促进m6A修饰的转录物的衰变，作者为了确定FBW7是否通过抑制YTHDF2来调节细胞m6A富集。通过使用LC-MS/MS测定细胞中m6A水平，作者发现YTHDF2的消融显著增加了卵巢癌细胞系OVCAR8和HEY（图6A）中的m6A丰度，这是基于HeLa细胞中进行的研究进行的。值得注意的是，FBW7的过表达导致SKOV3和OVCAR429细胞系中m6A水平的显著升高（图6B），这与YTHDF2耗竭的影响相似。此外，作者评估了具有高或低FBW7表达水平的卵巢癌组织中的m6A富集，这再次证实了FBW7表达与肿瘤中的m6A水平呈正相关（图1G）。值得注意的是，作者还确定FBW7介导的m6A丰度调节依赖于YTHDF2，事实证明，YTHDF2的敲低显著中和了FBW7耗竭对m6A水平的影响（图6C）。

接下来，作者通过进行RNA测序分析检查YTHDF2是否协调卵巢癌中的基因表达（图6D）。YTHDF2的消融导致SKOV3细胞中348个基因的上调和320个基因的下调。作者还通过MeRIP(m6A)测序分析对对照和YTHDF2耗尽的SKOV3细胞系中的m6A修饰进行了全基因组作图。结果表明，m6A峰主要位于CDS区域（42.3%），其次是终止密码子位点（32.9%）、起始密码子位点（14.5%）、5′UTR（7.7%）和3′UTR（2.6%）（图6E）。在SKOV3细胞中鉴定的m6A共有序列是GGAC[U/A]（图6F），这与之前的研究一致，表明YTHDF2也可能与卵巢癌中的m6A结合。通过整合RNA测序和m6A测序结果，作者发现具有39个峰的25个基因在YTHDF2敲低后持续升高（图6G和补充表4）。在这些失调的基因中，BMF被认为是一个有趣的靶标，因为它编码抑制促存活Bcl2成员和触发细胞凋亡所需的促凋亡BH3-onlyBcl2 家族蛋白，并且与YTHDF2相比，消融YTHDF2表现出更高的峰值富集对照组（图6H）。作者进一步证明，YTHDF2的消融显著增加BMF mRNA表达水平（图6I）并延长其半衰期（图6J），这验证了BMF mRNA作为YTHDF2降解的靶标。由于m6A修饰对于YTHDF2诱导的mRNA衰变是必不可少的，作者确定了m6A的抑制是否稳定了BMF mRNA。如图6k所示，用全局甲基化抑制剂3-脱氮腺苷(DAA)处理SKOV3细胞后，BMF的mRNA水平显着升高，表明甲基化对BMF mRNA的降解至关重要（图6K）。YTHDF2和BMF之间的相互作用通过RIP测定验证（图6I）。

YTHDF2的过表达显著降低了BMF的表达（补充图8A）。YTHDF2对细胞增殖和凋亡的影响可以通过恢复BMF表达来逆转（补充图8B-E）。FBW7的过表达，如YTHDF2的敲低，显着诱导BMF mRNA水平（图6M），这是由于异位FBW7对YTHDF2的降解（图3C-F）。此外，与SKOV3细胞中对照载体的修饰水平相比，FBW7的过表达或YTHDF2的敲低分别增加了BMF pre-mRNA的m6A修饰水平（图6N）。

作者还表明，FBW7介导的BMF调节依赖于YTHDF2（图6O和补充图12）。重要的是，与这些体外结果一致，作者还发现在卵巢癌组织中，BMF的表达与YTHDF2表达呈负相关（图6P），而与FBW7表达呈正相关（图6Q，补充图10）。并且FBW7表达水平较高的肿瘤患者的BMF mRNA水平升高，而YTHDF2mRNA水平没有显著差异（补充图11）。总的来说，作者的结果清楚地表明，FBW7通过与m6A阅读器YTHDF2相互作用并降解卵巢癌中的m6A阅读器YTHDF2，从而通过m6A依赖性机制激发促凋亡BMF的表达（图6R）。

【图6】【补充图8】【补充图10】【补充图12】三、总结

● 总之，作者的研究清楚地证明了卵巢癌中一个未被重视的FBW7-YTHDF2-BMF轴。FBW7与致癌YTHDF2相互作用并降解，从而导致m6A修饰的mRNA的稳定，包括促凋亡基因BMF的稳定，并损害卵巢癌细胞的存活和增殖。作者的研究结果还揭示了FBW7-YTHDF2-BMF轴的临床意义，这将为未来抗癌疗法的发展提供信息。